
Projekte der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. med. Johannes Schulte
Aktuell arbeitet die AG Schulte an folgenden Projekten:
Sie befinden sich hier:
- Hippo-YAP-Signalweg – Treibende Kraft für rezidivierende Neuroblastome?
- Die Rolle von zirkulären RNAs im Neuroblastom
- Next-Gen-Sequenzierungsansätze zur Charakterisierung von Schlüsselmechanismen in der Neuroblastom-Pathogenese
- Rolle und therapeutisches Potential des onkogenen IGF2BP1-MYCN-Netzwerks im Neuroblastom
- Detektion minimaler Resterkrankung für die Neuroblastom-Diagnostik
- Mausmodelle embryonaler Tumoren
Hippo-YAP-Signalweg – Treibende Kraft für rezidivierende Neuroblastome?
In verschiedenen Karzinomen wie bspw. dem Ovarial-, Lungen- oder in Leberkarzinom, wurde eine erhöhte Aktivität des Hippo-YAP-Signalweges beschrieben. Dieser Signalweg reguliert die Proliferation und auch die Epithelial-Mesenchymale Transition von Zellen, die eine Metastasierung sowie invasives Wachstum und eine starke Proliferationsrate ermöglicht.
Die bioinformatische Auswertung von RNA- und DNA-Sequenzierdaten primärer und rezidivierender Neuroblastome zeigte ebenfalls eine Aktivierung des Hippo-YAP-Signalweges, speziell in den Rezidiven des Neuroblastoms. In diesem Projekt untersuchen wir die Rolle des Hippo-YAP-Signalweges für die Pathogenese und Progression des Neuroblastoms. Methodisch wird die Manipulation der Expression und der Aktivität zentraler Proteine dieses Signalweges im Kontext des Neuroblastoms eingesetzt, um die Funktionen des Hippo-YAP-Signalweges und die dahinterstehenden Mechanismen für eine maligne Tumorerkrankung zu analysieren. Übergeordnetes Ziel in diesem Projekt ist die Identifikation neuer potentieller Zielstrukturen für eine gezielte Therapie von Hochrisiko-Neuroblastomen.
Die Rolle von zirkulären RNAs im Neuroblastom

Zirkuläre RNAs (circRNA) sind eine Klasse nicht-kodierender RNA, die erst vor kurzem in das Interesse der Forschung rückte. Eine der postulierten Funktionen von circRNAs ist die selektive Inhibition von microRNAs (miRNAs). Dies führt dazu, dass die von einer miRNA posttranskriptionell inhibierten mRNAs ungehindert exprimiert werden können. In diesem Projekt möchten wir einige circRNAs im Neuroblastom identifizieren und die Funktion von ausgewählten Kandidaten für die Pathogenese dieses Tumors untersuchen. Hierbei hoffen wir ein funktionelles Netzwerk aus circRNA, miRNA und Effektorgenen, wie z.B. MYCN beleuchten zu können.
So sollen neue funktionelle Kontrollpunkte im Neuroblastom enthüllt werden, welche letztendlich zur Identifikation neuer krankheitsassoziierter Zielmoleküle und einer besseren prognostischen Stratifizierung dieser Tumoren führen könnte.
Next-Gen-Sequenzierungsansätze zur Charakterisierung von Schlüsselmechanismen in der Neuroblastom-Pathogenese

Was sind die (epi-)genomischen Aberrationen, die zur Entwicklung von Neuroblastomzellen aus physiologischen Neuralleistenzellen führen?
Mithilfe von modernsten Verfahren der DNA-Sequenzierung, RNA-Sequenzierung und Epigenomik können wir die Genome, Epigenome und Transkripome von Tumorproben in einer Auflösung von einzelnen Basenpaaren charakterisieren. Unsere eigenen Sequenzierdaten werden zusammen mit öffentlich verfügbaren Genomdaten aus Neuroblastom-Zelllinien und Patientenproben ausgewertet. Eine gründliche bioinformatische Analyse dieser Daten unter Verwendung öffentlicher, auf dem neuesten Stand der Technik beruhender, und eigener, speziell angepasster Methoden identifiziert Kandidaten, die an wichtigen pathogenen Mechanismen beteiligt sind. Diese Kandidaten werden anschließend mit Validierungsexperimenten in unserem Labor nachverfolgt.
Um reproduzierbare Forschung in der Bioinformatik zu fördern, planen wir darüber hinaus, unsere eigenen Methoden in Form gut dokumentierter Softwarepakete zu veröffentlichen.
Rolle und therapeutisches Potential des onkogenen IGF2BP1-MYCN-Netzwerks im Neuroblastom
Mit dem Ziel, potentiell therapeutisch nutzbare onkogene Netzwerke zu identifizieren, welche Hochrisiko-Neuroblastomerkrankungen begünstigen, haben wir das Transkriptom und chromosomale Abweichungen mittels der Hochdurchsatzsequenzierung von RNAs, kleinen RNAs, sowie einfacher Gesamtgenomsequenzierung in 100 primären Tumorproben untersucht. Diese Befunde wurden mit öffentlich zugänglichen krebsartübergreifenden CRISPR-basierten Funktionsverluststudien, welche auch MYCN-amplifizierte Neuroblastomzelllinien umfassten, bewertet und verglichen. Hierbei zeigte sich eine signifikante Anreicherung essentieller Gene auf Chromosom 17q, welche in Hochrisiko-Neuroblastomen häufig angereichert sind.
Unter diesen Genen identifizierten wir IGF2BP1, ein onkofötales RNA bindendes Protein, welches als pro-tumorigener Verstärker im Neuroblastom identifiziert wurde. Studien in Zell-, Xenograft- und transgenen Neuroblastom-Mausmodellen zeigen, dass IGF2BP1 einen aggressiven Hochrisiko-Neuroblastomphänotypen durch eine Verstärkung der MYCN-getriebenen Genexpression begünstigt. Vorläufige Untersuchungen von MYCN/IGF2BP1-getriebenen Effektoren legen eine Reihe von therapeutisch angreifbaren Proteinen nahe, unter anderen Survivin (BIRC5), welches auf Chromosom 17q lokalisiert ist. Weitere vorläufige Untersuchungen zeigen darüber hinaus, dass die Inhibition von BIRC5 IGF2BP1-abhängig ist. Demzufolge erwarten wir, dass die gleichzeitige Inhibition von MYCN, IGF2BP1 und ihrer Effektoren therapeutische Vorteile hat. In diesem Projekt wollen wir:
1) die Rolle und das therapeutische Potential der MYCN/IGF2BP1-getriebene Genexpression in Hochrisiko-Neuroblastomen charakterisieren und
2) neue therapeutische Strategien evaluieren, welche auf die Inhibition der MYCN/IGF2BP1 getriebenen Genexpression abzielen. Das ultimative Ziel dieser prä-klinischen Anstrengungen ist es, die Therapie und Prognose für Hochrisikoerkrankungen zu verbessern.
Dieses Projekt wird in Kooperation mit Prof Dr. Stefan Hüttelmaier und seinem Team an der Martin-Luther-Universität Halle-Witenberg bearbeitet.
Detektion minimaler Resterkrankung für die Neuroblastom-Diagnostik

Die Risikostratifikation von Neuroblastomen basiert zurzeit auf verschiedenen Kriterien, inklusive des Amplifikationsstatus des MYCN Onkogens. Nahezu die Hälfte der Hochrisikopatienten erleidet einen Rückfall, was ein Vorhandensein von Tumorrestzellen und damit eine minimale Resterkrankung (MRD, minimal residual disease) impliziert. Für Leukämie-Patienten ist eine PCR basierte Detektion des MRD Status bereits klinisch-diagnostische Routine.
Wir entwickeln zusammen mit der Firma NEO New Oncology einen spezifischen 'NEO-NB' hybrid-capture-basierten Sequenzierungsassay, welcher die für das Neuroblastom relevanten, genomischen Alterationen detektiert. Bruchpunkte des MYCN-Amplikons, welche für jeden Patienten spezifisch sind, werden mit dem NEO-NB Assay analysiert, eindeutig bestimmt und sollen dazu benutzt werden, patienten-individuelle PCR Assays für die MRD Detektion zu konzipieren. Da das MYCN Amplikon stabil über den Verlauf der Krankheit ist, werden diese Alterationen auch in Tumorrestzellen erwartet. Als Beweis für unser Konzept wollen wir das 'NB-MRD' System für MYCN-Bruchpunkte in Neuroblastom-Zelllinien testen. Unser NB-MRD-Protokoll eignet sich für RQ-PCR und digital droplet PCR, und beide Techniken werden evaluiert.
Abschließend wollen wir Richtlinien für die Analyse und eine standardisierte Pipeline für patientenspezifische NB-MRD Detektion bereitstellen. Der NEO-NB-Assay wird in einer prospektiven Studie mittels FFPE- sowie Gefriermaterial primärer Tumorproben angewandt, um diese Assays für die Routinediagnostik bereitzustellen. Nach erfolgreicher Etablierung des Assays werden wir standardisierte Analysemethoden definieren, um NB-NRD für eine individuelle Patientendiagnostik zu etablieren.
Dieses Projekt wird in Kooperation mit Frau PD Dr. Cornelia Eckert, Herrn Prof. Dr. Matthias Fischer und NEO New Oncology bearbeitet.
Mausmodelle embryonaler Tumoren
In unserer Gruppe nutzen wir Mausmodelle, um die molekularen Mechanismen der Neuroblastompathogenese zu untersuchen.
Mithilfe dieser Modelle können wir sowohl zellintrinsische Faktoren als auch Wechselwirkungen des Tumors mit dem angrenzenden Mikromilieu untersuchen. Unser Fokus richtet sich dabei auf die Validierung und funktionelle Charakterisierung von Tumor-initiierenden Faktoren. Das Neuroblastom-Onkogen MYCN ist in ca. 25% der Neuroblastompatienten amplifiziert.
Dies untersuchen wir in einem Mausmodell mit einem Cre/loxP-System, welches eine Überexpression von humanem MYCN gewebsspezifisch in Zellen der Neuralleiste während der Embryonalentwicklung erlaubt. Dazu wird die cDNA des humanen MYCN Gens durch homologe Rekombination in den Rosa26-Lokus eingebracht. Die (Über-)Expression wird dabei von einer loxP-flankierten STOP-Kassette unterdrückt, welche nach Kreuzung mit Neuralleisten-spezifischen Cre-Stämmen (z.B. DBH-Cre, Phox2B-Cre, TH-Cre) entfernt werden kann. Das Spektrum an Mausmodellen kann dabei beliebig erweitert werden, um weitere Kandidatengene zu testen, wie z.B. LIN28B, ALK, BIRC5.
Unsere in vivo Systeme erlauben die Evaluation potentieller neuer Drug-targets für die präklinische Entwicklung neuer Therapiestrategien.