Schulte-Labor Word Cloud

Projekte der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. med. Johannes Schulte

Aktuell arbeitet die AG Schulte an folgenden Projekten:

Sie befinden sich hier:

Hippo-YAP-Signalweg – Treibende Kraft für rezidivierende Neuroblastome?

In verschiedenen Karzinomen wie bspw. dem Ovarial-, Lungen- oder in Leberkarzinom, wurde eine erhöhte Aktivität des Hippo-YAP-Signalweges beschrieben. Dieser Signalweg reguliert die Proliferation und auch die Epithelial-Mesenchymale Transition von Zellen, die eine Metastasierung sowie invasives Wachstum und eine starke Proliferationsrate ermöglicht.

Die bioinformatische Auswertung von RNA- und DNA-Sequenzierdaten primärer und rezidivierender Neuroblastome zeigte ebenfalls eine Aktivierung des Hippo-YAP-Signalweges, speziell in den Rezidiven des Neuroblastoms. In diesem Projekt untersuchen wir die Rolle des Hippo-YAP-Signalweges für die Pathogenese und Progression des Neuroblastoms. Methodisch wird die Manipulation der Expression und der Aktivität zentraler Proteine dieses Signalweges im Kontext des Neuroblastoms eingesetzt, um die Funktionen des Hippo-YAP-Signalweges und die dahinterstehenden Mechanismen für eine maligne Tumorerkrankung zu analysieren. Übergeordnetes Ziel in diesem Projekt ist die Identifikation neuer potentieller Zielstrukturen für eine gezielte Therapie von Hochrisiko-Neuroblastomen.

Die Rolle von zirkulären RNAs im Neuroblastom

Zirkuläre RNAs (circRNA) sind eine Klasse nicht-kodierender RNA, die erst vor kurzem in das Interesse der Forschung rückte. Eine der postulierten Funktionen von circRNAs ist die selektive Inhibition von microRNAs (miRNAs). Dies führt dazu, dass die von einer miRNA posttranskriptionell inhibierten mRNAs ungehindert exprimiert werden können. In diesem Projekt möchten wir einige circRNAs im Neuroblastom identifizieren und die Funktion von ausgewählten Kandidaten für die Pathogenese dieses Tumors untersuchen. Hierbei hoffen wir ein funktionelles Netzwerk aus circRNA, miRNA und Effektorgenen, wie z.B. MYCN beleuchten zu können.

So sollen neue funktionelle Kontrollpunkte im Neuroblastom enthüllt werden, welche letztendlich zur Identifikation neuer krankheitsassoziierter Zielmoleküle und einer besseren prognostischen Stratifizierung dieser Tumoren führen könnte.

Next-Gen-Sequenzierungsansätze zur Charakterisierung von Schlüsselmechanismen in der Neuroblastom-Pathogenese

MYCN Genregion mit alignierten Sequenzierdaten
MYCN Genregion mit alignierten Sequenzierdaten

Was sind die (epi-)genomischen Aberrationen, die zur Entwicklung von Neuroblastomzellen aus physiologischen Neuralleistenzellen führen?

Mithilfe von modernsten Verfahren der DNA-Sequenzierung, RNA-Sequenzierung und Epigenomik können wir die Genome, Epigenome und Transkripome von Tumorproben in einer Auflösung von einzelnen Basenpaaren charakterisieren. Unsere eigenen Sequenzierdaten werden zusammen mit öffentlich verfügbaren Genomdaten aus Neuroblastom-Zelllinien und Patientenproben ausgewertet. Eine gründliche bioinformatische Analyse dieser Daten unter Verwendung öffentlicher, auf dem neuesten Stand der Technik beruhender, und eigener, speziell angepasster Methoden identifiziert Kandidaten, die an wichtigen pathogenen Mechanismen beteiligt sind. Diese Kandidaten werden anschließend mit Validierungsexperimenten in unserem Labor nachverfolgt.
Um reproduzierbare Forschung in der Bioinformatik zu fördern, planen wir darüber hinaus, unsere eigenen Methoden in Form gut dokumentierter Softwarepakete zu veröffentlichen.

Die Rolle der MCPH-Gene in embryonalen Tumoren

Expression eines MCPH Gens in verschiedenen Geweben. Die Expression des MCPH Gens ist in Neuroblastomen und Medulloblastomen höher als in normalem Vergleichsgewebe.

Proliferationsstörungen spielen sowohl bei der Entstehung von Tumoren als auch der Genese von Entwicklungsstörungen des Gehirns eine wichtige Rolle. Während Tumorentstehung durch eine abnorme Zunahme der Proliferation gekennzeichnet ist, kann eine Mikrozephalie durch eine Reduktion der Stammzellproliferation bedingt sein. Der Prototyp einer Mikrozephalie, die autosomal-rezessive primäre Mikrozephalie (MCPH), ist genetisch heterogen und zeichnet sich durch eine Reduktion des Hirnvolumens in Folge einer Proliferationsstörung der neuralen Stammzellen aus. Die embryonalen Tumore Neuroblastom und Medulloblastom entstehen ebenfalls aus einer Proliferationsstörung der neuralen Stammzellen. Aufgrund der schlechten Prognose von Hochrisikofällen dieser Tumore ist ein besseres Verständnis der Tumorbiologie und die Identifizierung neuer Ansatzpunkte für zielgerichtete Therapien von größter Bedeutung. Unsere Hypothese ist, dass MCPH Genprodukte je nach Dosis ein Zuviel an Proliferation (Tumorentstehung) oder ein Zuwenig an Proliferation (Entwicklungsstörung / Mikrozephalie) verursachen können.

Ziel dieses Projektes ist es, die Rolle der MCPH Genprodukte in der Proliferation von Tumorzellen in Medulloblastom und Neuroblastom zu untersuchen. Insbesondere sollen die Interaktionspartner von CDK5RAP2 (MCPH3) identifiziert werden. Darüber hinaus werden die MCPH-Genexpressionsprofile in Tumoren analysiert und die Konsequenz einer Inhibition von MCPH-Genen in Tumoren charakterisiert.

Dieses Projekt wird in Kooperation mit Dr. A. Kaindl und  Prof. Dr. J. Klose (beide Charité) bearbeitet.

Detektion minimaler Resterkrankung für die Neuroblastom-Diagnostik

Ablaufschema des Neuroblastom-MRDs mittels Analyse und Detektion des patienten-spezifischen MYCN-Bruchpunktes

Die Risikostratifikation von Neuroblastomen basiert zurzeit auf verschiedenen Kriterien, inklusive des Amplifikationsstatus des MYCN Onkogens. Nahezu die Hälfte der Hochrisikopatienten erleidet einen Rückfall, was ein Vorhandensein von Tumorrestzellen und damit eine minimale Resterkrankung (MRD, minimal residual disease) impliziert. Für Leukämie-Patienten ist eine PCR basierte Detektion des MRD Status bereits klinisch-diagnostische Routine.

Wir entwickeln zusammen mit der Firma NEO New Oncology einen spezifischen 'NEO-NB' hybrid-capture-basierten Sequenzierungsassay, welcher die für das Neuroblastom relevanten, genomischen Alterationen detektiert. Bruchpunkte des MYCN-Amplikons, welche für jeden Patienten spezifisch sind, werden mit dem NEO-NB Assay analysiert, eindeutig bestimmt und sollen dazu benutzt werden, patienten-individuelle PCR Assays für die MRD Detektion zu konzipieren. Da das MYCN Amplikon stabil über den Verlauf der Krankheit ist, werden diese Alterationen auch in Tumorrestzellen erwartet. Als Beweis für unser Konzept wollen wir das 'NB-MRD' System für MYCN-Bruchpunkte in Neuroblastom-Zelllinien testen. Unser NB-MRD-Protokoll eignet sich für RQ-PCR und digital droplet PCR, und beide Techniken werden evaluiert.
Abschließend wollen wir Richtlinien für die Analyse und eine standardisierte Pipeline für patientenspezifische NB-MRD Detektion bereitstellen. Der NEO-NB-Assay wird in einer prospektiven Studie mittels FFPE- sowie Gefriermaterial primärer Tumorproben angewandt, um diese Assays für die Routinediagnostik bereitzustellen. Nach erfolgreicher Etablierung des Assays werden wir standardisierte Analysemethoden definieren, um NB-NRD für eine individuelle Patientendiagnostik zu etablieren.

Dieses Projekt wird in Kooperation mit Frau PD Dr. Cornelia Eckert, Herrn Prof. Dr. Matthias Fischer und NEO New Oncology bearbeitet.

Mausmodelle embryonaler Tumoren

In unserer Gruppe nutzen wir Mausmodelle, um die molekularen Mechanismen der Neuroblastompathogenese zu untersuchen.
Mithilfe dieser Modelle können wir sowohl zellintrinsische Faktoren als auch Wechselwirkungen  des Tumors mit dem angrenzenden Mikromilieu untersuchen. Unser Fokus richtet sich dabei auf die Validierung und funktionelle Charakterisierung von Tumor-initiierenden Faktoren. Das Neuroblastom-Onkogen MYCN ist in ca. 25% der Neuroblastompatienten amplifiziert.
Dies untersuchen wir in einem Mausmodell mit einem Cre/loxP-System, welches eine Überexpression von humanem MYCN gewebsspezifisch in Zellen der Neuralleiste während der Embryonalentwicklung erlaubt. Dazu wird die cDNA des humanen MYCN Gens durch homologe Rekombination in den Rosa26-Lokus eingebracht. Die (Über-)Expression wird dabei von einer loxP-flankierten STOP-Kassette unterdrückt, welche nach Kreuzung mit Neuralleisten-spezifischen Cre-Stämmen (z.B. DBH-Cre, Phox2B-Cre, TH-Cre) entfernt werden kann. Das Spektrum an Mausmodellen kann dabei beliebig erweitert werden, um weitere Kandidatengene zu testen, wie z.B. LIN28B, ALK, BIRC5.
Unsere in vivo Systeme erlauben die Evaluation potentieller neuer Drug-targets für die präklinische Entwicklung neuer Therapiestrategien.